在一項新的研究中，來自美國希望之城的研究人員將兩種強效的免疫療法---溶瘤病毒（oncolytic virus）和嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞（CAR-T）療法---結(jié)合起來，成功地靶向和*單獨用CAR-T細(xì)胞療法很難治療的實體瘤。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2020年9月2日的Science Translational Medicine期刊上，論文標(biāo)題為“Effective combination immunotherapy using oncolytic viruses to deliver CAR targets to solid tumors”。

當(dāng)溶瘤病毒被添加到癌細(xì)胞中后，它迫使大量的CD19在癌細(xì)胞表面上表達(dá)（紫色）。圖片來自 City of Hope。

在這項可能導(dǎo)致對難治性實體瘤患者進(jìn)行臨床試驗的臨床前研究中，這些研究人員通過對溶瘤病毒進(jìn)行基因改造，使之進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并誘導(dǎo)它們在腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)CD19蛋白。然后，他們能夠使用靶向CD19的CAR-T細(xì)胞來識別和攻擊這些實體瘤。

CD19 CAR-T細(xì)胞療法已被美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療某些類型的血液癌癥，即B細(xì)胞淋巴瘤和急性淋巴細(xì)胞白血病。這項新的研究可能會擴(kuò)大CD19 CAR-T細(xì)胞的使用范圍，用于治療可能患有任何實體瘤的患者。

論文共同通訊作者、希望之城血液學(xué)與造血細(xì)胞移植系助理教授Saul Priceman博士說，“我們的研究表明溶瘤病毒是一種強大而有前途的方法，可以與CAR-T細(xì)胞療法戰(zhàn)略性地結(jié)合起來，以便更有效地靶向?qū)嶓w瘤。”

Priceman補充道，“此外，這個治療平臺解決了使得實體瘤難以用免疫療法治療的兩大挑戰(zhàn)。CAR-T細(xì)胞可以靶向的實體瘤靶點是有限的。再者，實體瘤周圍是所謂的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境。當(dāng)一個CAR-T細(xì)胞試圖進(jìn)入腫瘤、存活并殺死癌細(xì)胞時，這種腫瘤微環(huán)境的存在使得它不能有效地做到這一點。”

論文共同通訊作者、希望之城外科腫瘤學(xué)主任、正在開發(fā)用于治療癌癥的溶瘤病毒的科學(xué)家Yuman Fong博士補充說，溶瘤病毒能夠突破這種腫瘤微環(huán)境。

Fong說，“我們設(shè)計這種溶瘤病毒是為了讓它做它擅長做的事情。它進(jìn)入癌細(xì)胞，并利用細(xì)胞自身的分子機(jī)器進(jìn)行自我復(fù)制，并能夠?qū)Π┘?xì)胞進(jìn)行重編程，使得它們表達(dá)一種截短的CAR-T細(xì)胞靶點：CD19。”

這些研究人員首先在Fong的實驗室中構(gòu)建出一種溶瘤病毒（OV19t），以便讓它進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并開始產(chǎn)生截短的CD19（CD19t）。他們在三陰性乳腺癌細(xì)胞系以及胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、頭頸癌和腦瘤細(xì)胞中成功地做到了這一點。然后，CD19 CAR-T細(xì)胞與OV19t在體外和針對小鼠的治療研究中進(jìn)行組合使用。

這些研究人員獲得了幾個關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)。論文作者、Priceman實驗室博士后研究員Anthony Park博士說，“當(dāng)我們用溶瘤病毒OV19t感染腫瘤細(xì)胞時，我們觀察到了表明這可能會發(fā)揮作用的信號。腫瘤細(xì)胞表達(dá)CD19t的時間比溶瘤病毒能夠殺死它們的時間要早得多，這給了我們一個利用CD19 CAR-T細(xì)胞靶向它們的機(jī)會窗口。這兩者的結(jié)合具有強大的協(xié)同效應(yīng)。”

這些研究人員還表明聯(lián)合使用溶瘤病毒和CAR-T細(xì)胞治愈了癌癥的小鼠表現(xiàn)出了長時間的保護(hù)性抗腫瘤免疫力。

Park補充道，“免疫系統(tǒng)建立了對腫瘤的記憶反應(yīng)。一旦在初的組合治療后，腫瘤被*，這些小鼠免受腫瘤復(fù)發(fā)。”

Park說，實體瘤通常在免疫學(xué)上是冷腫瘤，這意味著它們通常對利用身體自身免疫系統(tǒng)抵抗癌癥的療法沒有反應(yīng)。引入溶瘤病毒可逆轉(zhuǎn)不友好的腫瘤微環(huán)境，使之更容易接受CAR-T細(xì)胞療法。

這項研究展示了希望之城尋找更好的癌癥治療免疫療法的合作方式。幾年前，Priceman、Fong和希望之城血液惡性腫瘤研究所負(fù)責(zé)人Stephen Forman博士會面時針對如何將他們的專業(yè)知識---溶瘤病毒和CAR-T細(xì)胞療法---結(jié)合起來靶向?qū)嶓w瘤進(jìn)行了頭腦風(fēng)暴。

Priceman說，“這是一個簡單的概念，但經(jīng)過許多步驟，我們才有了今天的成就--我們?nèi)缃裾谠O(shè)計一項臨床試驗，在患者中測試這種組合。”

這項臨床試驗將首先在實體瘤患者中測試OV19t的安全性。如果發(fā)現(xiàn)這是安全有效的，那么就可以依次測試溶瘤病毒和CAR-T細(xì)胞療法。該臨床試驗預(yù)計將于2022年開始。
在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，因而細(xì)胞培養(yǎng)過程中被支原體污染是一個世界性的難題。當(dāng)細(xì)胞（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染后，細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA及蛋白表達(dá)發(fā)生改變，而細(xì)胞的生長率一般并未發(fā)生顯著的影響，因而細(xì)胞被支原體污染一般難以察覺。

支原體污染普遍存在，據(jù)美國數(shù)據(jù)統(tǒng)計，細(xì)胞發(fā)生支原體污染的幾率在70%以上。同時，由于支原體直徑很小，僅在180nm~350nm之間，只有通過電鏡才能看到，不易被實驗者肉眼發(fā)覺，支原體污染逐漸成為一個普遍存在的問題。本文締一生物為您分析細(xì)胞培養(yǎng)：關(guān)于支原體污染的危害。

支原體污染的危害

支原體污染是個循序的過程，普通抗生素對其無效。因此，支原體污染有多煩人，相信實驗人都領(lǐng)教過了。

1、細(xì)胞狀態(tài)不佳，生長速度慢，實驗無法推進(jìn)。

2、細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA及蛋白表達(dá)發(fā)生改變，影響實驗結(jié)果，導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，時間、經(jīng)費的浪費。

<!--[if !supportLists]-->3、<!--[endif]-->一株污染的細(xì)胞成為實驗室的污染源，對工作區(qū)域以及培養(yǎng)箱和液氮罐造成污染，進(jìn)而污染其他細(xì)胞，導(dǎo)致其他細(xì)胞繼發(fā)性污染，實驗受影響，數(shù)據(jù)無法重復(fù)，預(yù)期結(jié)果出不來。

實驗者可選用對支原體的抑制劑，通過對細(xì)胞的前期處理，中期加藥，逐步通過4代左右的培養(yǎng)，從而將支原體污染*清除，確保試驗順利推進(jìn)，結(jié)果準(zhǔn)確。*此類試劑眾多，北京締一生物周圍的實驗人做過很多嘗試，其中效果確切且性價比很高的當(dāng)屬德國Minerva公司的ZellShield®支原體祛除劑。

預(yù)防及處理

組織細(xì)胞培養(yǎng)工作中，可以從以下幾方面來預(yù)防支原體的污染：

控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實驗操作；細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌；在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。

當(dāng)細(xì)胞被支原體污染后若由于材料的特殊性必須保留可以采用一定的抗生素進(jìn)行處理，對支原體抑制活性抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等。目前，市場上已有了新一代支原體抗生素M-Plasmocin，能有效的殺滅支原體，又不影響細(xì)胞本身的代謝，而且處理過的細(xì)胞不會重新感染支原體。另外，配合支原體檢測試劑盒可以幫助盡快發(fā)現(xiàn)支原體的污染。